PCR voorbeeld cloning strategies

Gebruikersavatar
AdamCooman
The IRW God
The IRW God
Berichten: 2376
Lid geworden op: 28 nov 2007, 18:19
Locatie: Aalst
Contacteer:

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor AdamCooman » 16 jun 2010, 12:02

ik ben u een PCR gids aan het schrijven, geef mij efkes
AdamCooman The IRW God
Als een link niet meer werkt, bezoek mijn site om het bestand te vinden
Afbeelding

Mooiste avatar: AdamCooman
Beste moderator: AdamCooman
Gebruikersavatar
AdamCooman
The IRW God
The IRW God
Berichten: 2376
Lid geworden op: 28 nov 2007, 18:19
Locatie: Aalst
Contacteer:

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor AdamCooman » 16 jun 2010, 12:48

Eiwit waarmee we beginnen

Code: Selecteer alles

NH2-Ala-Glu-Leu-Pro-Trp-Asp-Thr-...//...Met-Phe-Cys-Tyr-Tyr-Ala-Lys-..COOH

Door gebruik te maken van de tabel die de codering van aminozuren geeft (drie baseparen per aminozuur) kunnen we het overeenkomend mRNA vinden.
Afbeelding
De code is gegeven van 5' naar 3', de mRNA streng loopt dus ook van 5' naar 3'

Code: Selecteer alles

 5’-GCA.GAA.CUA.CCA.UGG.GAC.ACA    //   AUG.UUC.UGC.UAC.UAC.GCA.AAA  3’
      C   G   C   C       U   C               U   U   U   U   G   G
      G       G   G           G                               C
      U       U   U           U                               U

Het stuk DNA dat daarmee overeenkomt is dubbelstrengig en bevat dus het RNA en het complement van dit RNA
DNA gebruikt T in plaats van U
G -> C
A -> T
C -> G
U -> A

Dat geeft

Code: Selecteer alles

     A       A   A           A                               A
     C       C   C           C                               G     
     G   C   G   G       A   G               A   A   A   A   C   T
3'-CGT.CTT.GAT.GGT.ACC.CTG.TGT    //   TAC.AAG.ACG.ATG.ATG.CGT.TTC  5’
-----------------------------------------------------------------------
5’-GCA.GAA.CTA.CCA.TGG.GAC.ACA    //   AUG.TTC.TGC.UAC.UAC.GCA.AAA  3’
     C   G   C   C       T   C               T   T   T   T   G   G
     G       G   G           G                               C
     T       T   T           T                               T

We zoeken nu de primers, Een zal binden aan de 3'-5' streng en de andere zal binden aan de 5'-3' streng. Omdat DNA polymerase altijd aan de 3' kant werkt moet het begin van het eiwit dus een 5'-3' primer hebben en het einde een 3'-5', want ze moeten naar elkaar toe groeien.

Code: Selecteer alles

     A       A   A           A                               
     C       C   C           C                                   
     G   C   G   G       A   G               
3'-CGT.CTT.GAT.GGT.ACC.CTG.TGT    //      <-- PRIMER 2              5’
-----------------------------------------------------------------------
5’-  PRIMER 1 -->                 //   AUG.TTC.TGC.UAC.UAC.GCA.AAA  3’
                                             T   T   T   T   G   G
                                                             C
                                                             T

Voor het primer 1 is de primer dus het complement van

Code: Selecteer alles

     A       A   A           A 
     C       C   C           C     
     G   C   G   G       A   G 
3'-CGT.CTT.GAT.GGT.ACC.CTG.TGT -5'                             

Wat natuurlijk de oorspronkelijke RNA streng is, bespaar u dus de moeite en sla het complementeren van dit deel over in het vervolg.

Omdat er keuze is voor bepaalde baseparen, en we onmogelijk kunnen weten welke base juist in het oorspronkelijk DNA staat voeren we jokers in:
Als alle 4 keuzes mogelijk zijn gebruiken we N
Als A en G mogelijk zijn gebruiken we R
Als C en T mogelijk zijn gebruiken we Y

Toepassen hiervan op onze primer geeft

Code: Selecteer alles

5’-GCN.GAR.CTN.CCN.TGG.GAY.ACN-3'
                   ^^^ ^^                     

Om de DNA sequentie te herkennen op de oorspronkelijke streng moet een zo lang mogelijk uniek stuk primer gevonden worden (dit bevat dus geen jokers) Voor deze primer vinden we 5 opeenvolgende unieke basen (aangeduid met ^), we kiezen die dus als einde van de primer.

Code: Selecteer alles

5’-GCN.GAR.CTN.CCN.TGG.GA-3'
                   ^^^ ^^                     

Daarnaast wordt er best een site voorzien voor een restrictieenzym (waarom is een groot mysterie op dit moment), We hebben verschillende enzymes gezien in de les die een bepaalde sequentie herkennen en knippen (ze zijn altijd complementsymmetrisch). Ik geef altijd de 5'-3' codering

Code: Selecteer alles

Sac I : GAG-CTC
Mlu I : TGC-GCA
Bol T : ACT-AGT
Bam HI: GGA-TCC
Eco RI: GAA-TTC
Xho I : GAG-CTC
...

(er zijn er veel, geef voorkeur aan die die geen blunt ends veroorzaken, maar dat leidt ons te ver)
We herkennen (toevallig) de site van Sac I in onze primer Hiervoor moeten we wel de R vervangen door een G en de N door een C (dat mag)
We bekomen uiteindelijk voor de eerste primer

Code: Selecteer alles

5’-GCN.GAG.CTC.CCN.TGG.GA-3'
       ||| |||     ^^^ ^^               

||| duidt de restrictiesite aan
^^^ duidt de bindingssite aan


We passen hetzelfde toe om de tweede primer te verwezenlijken.
Primer twee zal het complement zijn van het mRNA dat we vonden na vertaling van het eiwit. Dat geeft

Code: Selecteer alles

3'-TAC.AAR.ACR.ATR.ATR.CGN.TTY  5’
   ^^^ ^^

Nu kijken we naar het begin van de streng om unieke basen te vinden en vinden daar 5 opeenvolende, die nemen we dus

Voor de bindingssite van het restrictieenzym hebben we een probleem, er zit komt geen enkele restrictiesite overeen met wat we in onze primer hebben, Dit kunnen we oplossen door een base in de primer te veranderen of door een base toe te voegen aan de primer



tenslotte bepalen we (ongeveer) de Annealing temperatuur voor de PCR. hiervoor hebben we de volgende formule
Ta = (#A + #T)*2°C + (#C + #G)*4°C - 5°C
met #A het aantal basen A in de primer.
Voor de jokers wordt er niets bijgeteld, zelf niet als die ingevuld is om een restrictiesite te bekomen
Het is het best dat de annealing temperatuur voor beide primers ongeveer dezelfde is.
AdamCooman The IRW God
Als een link niet meer werkt, bezoek mijn site om het bestand te vinden
Afbeelding

Mooiste avatar: AdamCooman
Beste moderator: AdamCooman
Gebruikersavatar
ideglier
Prof in de forumwetenschappen
Prof in de forumwetenschappen
Berichten: 5400
Lid geworden op: 11 okt 2008, 18:27
Locatie: Asse

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor ideglier » 16 jun 2010, 13:45

ge zijt een held Adam :)
Alleen heb ik een opmerking bij uw allerlaatste opmerking: het begin van de streng dat ge hier bedoelt is dus de 3'. Maar als je alleen de eerste 5 neemt, dan is er toch een probleem want een primer van 5 baseparen is toch veel te klein? Of bedoel je daarmee iets anders?
I love the smell of petrol in the morning. Smells like ... SPEED!
Afbeelding
Gebruikersavatar
AdamCooman
The IRW God
The IRW God
Berichten: 2376
Lid geworden op: 28 nov 2007, 18:19
Locatie: Aalst
Contacteer:

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor AdamCooman » 16 jun 2010, 14:00

Ge houdt die daarachter ook wel nog bij, ge kijkt nu gewoon eigenlijk omgekeerd. Bij de beginprimer hebt ge
5' - rommel -restrictiesite - rommel - unieke basen 3'
Bij de eindprimer hebt ge
3' - unieke basen - rommel - restrictie site - rommel - 5'

eigenlijk is dat twee keer hetzelfde, ge draait het gewoon om
AdamCooman The IRW God
Als een link niet meer werkt, bezoek mijn site om het bestand te vinden
Afbeelding

Mooiste avatar: AdamCooman
Beste moderator: AdamCooman
Gebruikersavatar
ideglier
Prof in de forumwetenschappen
Prof in de forumwetenschappen
Berichten: 5400
Lid geworden op: 11 okt 2008, 18:27
Locatie: Asse

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor ideglier » 16 jun 2010, 14:18

oke thx!
I love the smell of petrol in the morning. Smells like ... SPEED!
Afbeelding
ward
Regelmatig forumgebruiker
Regelmatig forumgebruiker
Berichten: 76
Lid geworden op: 22 mar 2010, 13:52

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor ward » 16 jun 2010, 20:51

AdamCooman schreef:Om de DNA sequentie te herkennen op de oorspronkelijke streng moet een zo lang mogelijk uniek stuk primer gevonden worden (dit bevat dus geen jokers) Voor deze primer vinden we 5 opeenvolgende unieke basen (aangeduid met ^), we kiezen die dus als einde van de primer.

Code: Selecteer alles

5’-GCN.GAR.CTN.CCN.TGG.GA-3'
                   ^^^ ^^                     


Eigenlijk knipt ge in deze stap alle basen af van de primer tot ge in een codon 2 opeenvolgende baseparen hebt die geen joker zijn, nee ?
Is op het examen na deze afknipping de oefening niet gedaan ? Ik zie het nut niet goed van alles wat erachter komt en ik herinner mij precies ook niet dat we dat in die laatste les allemaal gedaan hebben..
Nice gids btw.
Gebruikersavatar
AdamCooman
The IRW God
The IRW God
Berichten: 2376
Lid geworden op: 28 nov 2007, 18:19
Locatie: Aalst
Contacteer:

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor AdamCooman » 16 jun 2010, 21:02

bwa, het is altijd handig om meer basenparen te hebben die geen joker zijn, zeker als ge de PCR moet toepassen op een volledig genoom, twee is nogal weinig om echt selectief te zijn. het minimum is twee
AdamCooman The IRW God
Als een link niet meer werkt, bezoek mijn site om het bestand te vinden
Afbeelding

Mooiste avatar: AdamCooman
Beste moderator: AdamCooman

Terug naar “Biotechnologie”

Wie is er online

Gebruikers op dit forum: Geen geregistreerde gebruikers en 1 gast

cron