PCR voorbeeld cloning strategies

Gebruikersavatar
ideglier
Prof in de forumwetenschappen
Prof in de forumwetenschappen
Berichten: 5400
Lid geworden op: 11 okt 2008, 18:27
Locatie: Asse

PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor ideglier » 16 jun 2010, 10:49

om die primers te zoeken heb ik toch een aantal probleempjes:
- Men heeft 7 codons langs elke kant van de ...//...-DNA sequentie
- Dan zoekt men de overeenkomstige baseparen in de mRNA
- Nu zoekt men de primers. De U wordt vervangen door T enz. Maar voor primer 1 heb ik een aantal vragen:
- waarom vervangt men sommige letters door N (wat erop duidt dat men 4 mogelijkheden heeft), en waarom sommigen niet zoals de onderstreepte?
- waarom beschouwt men in primer 1 het laatste codon ACA niet? Waarom stopt men bij GA-?
- Dan voor primer 2:
- waarom moet men er nog nucleotides bijplaatsen? Zoals in het eerste geval, clamp addition: vanwaar komt opeens die Y en die vetgedrukte G ... AG? En wat doet die daar en waarom?
- 1 nucleotide invoegen: waarom precies C toevoegen tussen T en A in Bcl I? Waarom niet bijv. G? En waarom daar?

En algemeen: waarom zijn die 6 baseparen de restrictie-enzyme sites? Dat snap ik niet, waarom juist daar en geen bijv. 4 baseparen verderop?
I love the smell of petrol in the morning. Smells like ... SPEED!
Afbeelding
Gebruikersavatar
AdamCooman
The IRW God
The IRW God
Berichten: 2376
Lid geworden op: 28 nov 2007, 18:19
Locatie: Aalst
Contacteer:

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor AdamCooman » 16 jun 2010, 11:14

Restrictie enzyme is om te knippen

Het hangt ervan af wat ge in uw kast hebt liggen natuurlijk, maar een restrictieenzym dat op 6 basenbaren knipt is beter omdat ge minder kans hebt dat het nog ergens anders knipt dan waar ge wilt.

Omdat die code waar dat enzym knipt vastligt
In dit geval voor Sac I: GAG.CTC
Moet dat natuurlijk in uw primer voorkomen, dus daar legt ge de code vast.
Bij die andere vervangt ge het door een N

Ge maakt uw uiteinde zo lang en duidelijk mogelijk, In dit geval zijn er 5 opeenvolgende basenparen zonder keuzemogelijkheid, die neemt ge als einde
AdamCooman The IRW God
Als een link niet meer werkt, bezoek mijn site om het bestand te vinden
Afbeelding

Mooiste avatar: AdamCooman
Beste moderator: AdamCooman
Gebruikersavatar
ideglier
Prof in de forumwetenschappen
Prof in de forumwetenschappen
Berichten: 5400
Lid geworden op: 11 okt 2008, 18:27
Locatie: Asse

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor ideglier » 16 jun 2010, 11:21

ah oke cava, en wat met primer 2? Indien de restrictiecode ni in uw primer ligt, voegt ge daar gewoon ewa code (baseparen) bij ofzo? Waarom hebt ge feitelijk een restrictiesite nodig? Waarom wilt ge uw primer bijvoorbeeld opsplitsen? En wat betekent die Y?
I love the smell of petrol in the morning. Smells like ... SPEED!
Afbeelding
Gebruikersavatar
AdamCooman
The IRW God
The IRW God
Berichten: 2376
Lid geworden op: 28 nov 2007, 18:19
Locatie: Aalst
Contacteer:

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor AdamCooman » 16 jun 2010, 11:27

Ge hebt naast N dat ge gebruikt als 'joker' voor de 4 keuzes ook nog een 'joker' voor als ge twee keuzes hebt
Y als het C of T is
R als het G of A is

allé ja, dat zit ik er toch in
AdamCooman The IRW God
Als een link niet meer werkt, bezoek mijn site om het bestand te vinden
Afbeelding

Mooiste avatar: AdamCooman
Beste moderator: AdamCooman
Gebruikersavatar
ideglier
Prof in de forumwetenschappen
Prof in de forumwetenschappen
Berichten: 5400
Lid geworden op: 11 okt 2008, 18:27
Locatie: Asse

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor ideglier » 16 jun 2010, 11:29

ja tuurlijk :) het wordt me effe te veel :P .
Maar ik vraag me nog steeds af waarom je daar baseparen bijvoegt voor die restrictieenzymes. Die restrictieenzymes moeten toch uw primer niet knippen? Of binden ze op die site en knippen ze dan iets verder op? En moogt ge da zomaar doen die code bijvoegen? Ik weet het niet meer, ik slaag echt alles door elkaar...
Laatst gewijzigd door ideglier op 16 jun 2010, 11:30, 1 keer totaal gewijzigd.
I love the smell of petrol in the morning. Smells like ... SPEED!
Afbeelding
Gebruikersavatar
AdamCooman
The IRW God
The IRW God
Berichten: 2376
Lid geworden op: 28 nov 2007, 18:19
Locatie: Aalst
Contacteer:

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor AdamCooman » 16 jun 2010, 11:30

en ja, zo te zien mag het dat ge een base toevoegt om een restrictiesite te creëeren, omdat ge toch redelijk ver van de bindingssite zit moogt ge vanalle foefkes uithalen om het in orde te krijgen
Ik zou het bij de gewone methode houden moest ik u zijn

Is er ergens een lijst met restrictiesites en hun overeenkomend eiwit?
AdamCooman The IRW God
Als een link niet meer werkt, bezoek mijn site om het bestand te vinden
Afbeelding

Mooiste avatar: AdamCooman
Beste moderator: AdamCooman
Gebruikersavatar
AdamCooman
The IRW God
The IRW God
Berichten: 2376
Lid geworden op: 28 nov 2007, 18:19
Locatie: Aalst
Contacteer:

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor AdamCooman » 16 jun 2010, 11:36

ideglier schreef:Maar ik vraag me nog steeds af waarom je daar baseparen bijvoegt voor die restrictieenzymes. Die restrictieenzymes moeten toch uw primer niet knippen? Of binden ze op die site en knippen ze dan iets verder op? Ik weet het niet meer, ik slaag echt alles door elkaar...


. The primers should have a length between 15 and 24 nucleotides, preferably containing a restriction enzyme site. These restriction enzyme sites should be included, either internally, or if necessary at the 5' end extended with a few bases as a clamp. Try to make the two primers in such a way that their expected annealing temperature are in the same range, and around 60 to 65°C.


Geen idee wanneer die restrictieenzymes gebruikt worden eigenlijk
AdamCooman The IRW God
Als een link niet meer werkt, bezoek mijn site om het bestand te vinden
Afbeelding

Mooiste avatar: AdamCooman
Beste moderator: AdamCooman
Gebruikersavatar
ideglier
Prof in de forumwetenschappen
Prof in de forumwetenschappen
Berichten: 5400
Lid geworden op: 11 okt 2008, 18:27
Locatie: Asse

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor ideglier » 16 jun 2010, 11:38

AdamCooman schreef:en ja, zo te zien mag het dat ge een base toevoegt om een restrictiesite te creëeren, omdat ge toch redelijk ver van de bindingssite zit moogt ge vanalle foefkes uithalen om het in orde te krijgen
Ik zou het bij de gewone methode houden moest ik u zijn

Is er ergens een lijst met restrictiesites en hun overeenkomend eiwit?


ik zou het echt niet weten... wa is precies weeral die bindingsite? :)
I love the smell of petrol in the morning. Smells like ... SPEED!
Afbeelding
Gebruikersavatar
AdamCooman
The IRW God
The IRW God
Berichten: 2376
Lid geworden op: 28 nov 2007, 18:19
Locatie: Aalst
Contacteer:

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor AdamCooman » 16 jun 2010, 11:42

Ik heb dat hier terplaatse uit mijn duim gezogen, maar ik bedoel er die laatste baseparen mee, met die paren gaat de primer op het juiste stuk van het DNA binden
AdamCooman The IRW God
Als een link niet meer werkt, bezoek mijn site om het bestand te vinden
Afbeelding

Mooiste avatar: AdamCooman
Beste moderator: AdamCooman
Gebruikersavatar
ideglier
Prof in de forumwetenschappen
Prof in de forumwetenschappen
Berichten: 5400
Lid geworden op: 11 okt 2008, 18:27
Locatie: Asse

Re: PCR voorbeeld cloning strategies

Berichtdoor ideglier » 16 jun 2010, 11:46

ah oke heel erg bedankt voor de hulp want ik zie tees echt ni meer zitte :P
I love the smell of petrol in the morning. Smells like ... SPEED!
Afbeelding

Terug naar “Biotechnologie”

Wie is er online

Gebruikers op dit forum: Geen geregistreerde gebruikers en 1 gast

cron